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    項目簡介:

     多糖屬于結構多樣化的一類大分子,單糖殘基之間通過糖苷鍵彼此連接的。與其他生物聚合物如蛋白質和核酸相比,多糖提供最高的能力攜帶生物,因為它們有最大的結構潛力可變性。多糖的來源多種多樣。多糖它起源于光合作用較強的植物、真菌、藻類、細菌等。在細胞水平上,多糖代表儲存在細胞質中的化合物(如淀粉),或生物膜或細胞壁的結構成分(如纖維素)。

    多糖的分離、純化基本上決定了多糖的結構特征。因此,分離純化是多糖進行結構分析的首要核心步驟。


      該部分項目主要針對樣品為粗多糖,即已經經過提取獲得的粗提物,可以是熱水提取乙醇沉淀、酸水解提取、堿水解提取、超聲提取、酶法提取等。提取的方法這里不在贅述。

    項目采用的方法:

      從本質上講,很難清楚區分多糖分離和多糖純化,有時多糖分離已經包含了多糖純化,例如,在提取多糖的過程中,首先要用水來提取的,然后用堿性溶液提取。所以水溶性多糖和堿溶性多糖根據其在水/堿中的溶解度進行分離。另一方面,有時多糖純化也包含多糖分離。例如,雜質在柱層析純化中進一步分離。博睿糖生物在該方面具有扎實的基本功。

    1)   柱色譜法

    柱色譜法是是目前應用最廣泛的色譜法多糖的純化方法,由于其純化效果好,操作簡單。柱層析有以下幾種方法:

    ①纖維素柱層析法。纖維素是很常見的柱色譜填料。首先,柱中的纖維素是用乙醇溶液平衡,然后是多糖加載在纖維素柱上進行純化。隨后,分別用淋洗液洗脫纖維素柱,從而不同的多糖組分可以依次洗脫。低分子量多糖先被洗脫,然后高分子量多糖被洗脫。在洗脫過程中,各不相同多糖組分最終可以相互分離。這個方法是所謂“分級解離法”,實質上與分級醇沉的方法相反。但該方法的缺點是流量小、耗時長。特別是對酸性多糖粘度高時,似乎流速過低。而博睿糖生物,針對該類樣品具有自己獨特的一套樣品處理、上樣和放大實驗設備,很好解決以上問題。

    ②陰離子交換柱層析法。這是目前采用柱色譜法中最常用的多糖純化方法。對于粗多糖溶液,通常首先采用柱層析法特別是陰離子交換柱層析方法進行分離。經此方法多糖溶液可被濃縮和得到初步純化,部分多糖甚至可以直接獲得均一多糖。到目前為止廣泛使用的陰離子交換劑有DEAE-纖維素、DEAE-SephadexDEAE-Sepharose,其中通常以DEAE-cellulose居首選擇。DEAE-纖維素具有開放的框架多糖分子可以自由進入載體并迅速擴散。博睿糖生物DE52纖維素填料(貨號BRS008)是一款自主研發的專門用于多糖分離的纖維素填料,該填料具有較大的表面積。盡管它的離子交換容量僅為0.70 ~ 0.75 mmol/g,吸收DE52纖維素轉化為多糖的量遠大于離子交換樹脂。此外,由于纖維素上的離子交換基團較少,排列松散,呈堿性,吸附能力較強DE52纖維素填料對多糖的作用較弱,為多糖可以用一定離子濃度的鹽溶液洗脫。DE52纖維素填料填充后的陰離子交換柱適合于分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。陰離子交換柱色譜法可用于中性和酸性多糖的分離,以及不同中性多糖的分離。

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    一般而言,100g DE52纖維素填料可負重0.5-1.5 g干多糖樣品。通常采用不同離子強度的緩沖液可進行梯度洗脫或逐步洗脫。除DE52-纖維素外,其他兩種陰離子交換劑,即DEAE-SephadexDEAE-Sepharose也被廣泛使用。博睿糖生物公司一般提供的多糖分離技術服務為多糖極性分離,即上述方法。

    應用案例1:分離流程:洗脫曲線:

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    ③凝膠柱層析法。凝膠柱層析是根據多糖的大小和形狀進行分離多糖分子的,即分子篩的原理。這種色譜法被廣泛應用于分離后多糖的純化。一般來說,先用陰離子交換柱層析法對所得粗多糖進行初步純化,然后再用凝膠柱層析法進一步純化。常用的凝膠有各種類型的Sephadex, Sepharose等。淋洗液是不同濃度的鹽溶液和緩沖液。博睿糖生物自主研發的全自動凝膠純化系統(GPC Autopurifier System,BRT-GS),可實現不同分子量多糖的分離。能夠實現連續進樣、在線監測、重復性好,樣品收集和純化效率高。博睿糖生物公司一般提供的多糖純化技術服務為多糖凝膠純化,采用以上設備和上述方法。

    (原理,參考文獻:Molecules. 2019 Sep; 24(17): 3122)

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    *以下案例:兩種不同分子量的多糖得到了完全分離。

    *純化前:至少2種不同分子量大小的多糖;*純化后:對稱單峰、均一多糖;

    凝膠純化前:                         凝膠純化后:      

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    2)分級沉淀方法也叫分級醇沉。

    這種方法的原理是不同的多糖組分在低醇或酮(通常是乙醇或丙酮)中有不同的溶解度。和分子量小的多糖相比,分子量越大的多糖其在乙醇或丙酮中的溶解度越低,所以逐漸增加乙醇或丙酮的濃度會沉淀不同分子量的多糖。常用的操作步驟如下:高濃度或無水乙醇慢慢加入多糖混合溶液中后攪拌至終乙醇濃度達到15% (v/v)。加入乙醇后放置2 h,離心取上清和沉淀(可稱為“一級沉淀”)。該沉淀物為高分子量的多糖組分。繼續攪拌,將乙醇緩慢加入上清液中使溶液的終乙醇濃度達到25% (v/v)。溶液靜置2h后離心,得到上清液和沉淀(可稱為“二級沉淀”)。第二個沉淀也是多糖組分,但其分子量低于第一沉淀物。分級沉淀過程可以進一步進行,這取決于實際情況。分級沉淀法比柱色譜法簡單多了,因此該方法為研究和化妝品、保健品開發的首選方法。

    3)       鹽析

    該方法的原理是不同分子量的多糖組分在一定濃度的鹽溶液中其溶解度不同。當一種中性鹽(NaCl、KCl、(NH4)2SO4)添加到多糖溶液中,達到一定的濃度濃縮后,多糖餾分將作為萃取物分離出來的形式沉淀。這個多糖部分和上清可分別通過離心得到。繼續將這種鹽添加到得到的上清液中,因此另一個多糖餾分會沉淀出來。鹽析法應用廣泛用于蛋白質純化。在前期,PSK的純化采用該方法制備。鹽析法性價比高,但其效率低,易形成共沉淀。

    4)    金屬協調方法

    不同的多糖能與各種金屬離子(銅、鋇、鈣、鋅和鉛等)形成配位化合物沉淀。這一性質也可用來分離和純化多糖。常用的協調劑主要有CuCl2, Ba(OH)2, Pb(CH3COO)2。得到的配位化合物沉淀物首先被充分洗滌水,然后用酸分解得到游離多糖。在多糖純化中,最常用的是銅鹽與Ba(OH)2配位法。在銅鹽中配合法,常用沉淀多糖試劑分別為CuCl2溶液、CuSO4溶液、Cu(CH3COO)2等。該方法步驟繁瑣,且多糖有金屬離子,后期結構解析有干擾而少用。

     

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